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中国试管婴儿网:随着遗传学在辅助生育中的深入，在研究了很多的胚胎培养染色体异常、着床失败、胎停流产等案例之后，在内膜、囊肿、线粒体、免疫等方向上反复纠结之后，试管婴儿医生将目光重新聚焦到染色体上来
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那么，什么是染色体异常?？ 什么是染色体异常? 染色体是遗传物质DNA的主要载体，人体一共有23对，其中前22对为常染色体，第23对为性染色体，用来决定性别。
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每一对的染色体或遗传因子不孕不育在细胞的减数分裂时会彼此分离，再进入不同的子细胞中，不同对的染色体或遗传因子可以自由组合。 染色体异常通常表现为染色体的缺失、易位、数目增多、重复、出现三倍体等等。染色体异常中最典型和最常见的是非二倍体，即某一条染色体的数量只有一条或者三条。最常见的是21三体唐氏综合症(即21号染色体有三条，也称先天愚型)，其次是18三体爱德华症(18号染色体有三条)。 除了非二倍体，还有染色体结构(比如罗氏易位)以及基因层面的异常。目前已知的基因遗传病有7000多种，其中125种可以被三代试管PGD/PGS技术检出。 为什么发生染色体异常? 临床研究将原因归于以下几类： 1、大龄生育，减数分裂异常导致染色体不分离 2、辐射，导致染色体确实、易位或断裂 3、病毒 4、自体免疫性疾病 5、化学药品如化疗药物 受精卵的染色体源于卵子和精子。卵子成熟过程中会发生减数分裂，即从两条染色体拆分成单条染色体，受精后再与精子的单条染色体重新结合成二倍体。 老化的卵子更容易发生减数分裂异常，也就是成熟卵子中将带有0条或2条染色体，受精以后会导致受精卵的染色体变成1条或者3条，非二倍体的概率增加。所以，染色体异常才是卵子老化质量下降的第一大杀手。 针对染色体的治疗 引发染色体易异常的原因很多，常见的染色体易位与内分泌紊乱紧密相关，无论男性还是女性，染色体异常的几率都会随着年龄的增长而增加，相应出现的问题就是精子异常、卵子染色体易位。除此以外，滥用药物、环境污染、辐射等等都会造成染色体易位。有些染色体异常的患者是可以找到发病原因的，如果是男性内分泌异常所致，就应当进行系统检查，找出具体原因，有针对性地治疗。
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同时要对药物、饮食、生活环境尽量加以调整，可尽力避免。 目前针对染色体的治疗，并没有十分有效的方式，如果是隐性的染色体异常，不会给生活带来影响，如果是显性的智能障碍，唯有通过漫长的中药治疗与**训练，而且效果也不见得理想。 如何解决染色体异常生育问题 要解决染色体异常带来的生育问题，只有利用技术将胚胎做出筛查，这项技术就是已经被大众所熟知和了解的海外第三代试管婴儿PGD技术。试管婴儿是人工提取出女性的卵子和男性的精子，在体外培育成胚胎后再植入母体，这项技术可以帮助输卵管有问题导致不孕的女性以及精子活力低下、少精畸精导致不育的男性来生育，发展到现在还可以对胚胎进行筛查，挑选出没有任何疾病的健康胚胎再人工植入到子宫里，这个筛查的过程就是PGS筛查技术。 PGS是种植前染色体筛查技术，十分适用于帮助筛选胚胎染色体非整倍体，帮助解决因胚胎基因异常引起的不孕或流产，以及对平衡易位的夫妇选择基因平衡的胚胎进行移植。从根本上提高了第一代和第二代的试管婴儿妊娠成功率效，降低自然流产率，提高妊娠质量，可有避免因盲目移植，结果是携带异常基因的胚胎而不得不在孕期终止妊娠。 中国试管婴儿网:染色体在形态结构或数量上异常被称为染色体异常。染色体异常看似陌生、好像离我们很远，但其实并不罕见染色体易位，人群中大约每五百人就可能有一人是染色体易位，而且染色体异常的发生没有性别的差异，男性和女性都有可能出现染色体异常。 由染色体异常引起的疾病为染色体病，医学上现已发现的染色体病有100余种，染色体病在临床上常可造成流产、先天愚型、先天性多发性畸形以及癌肿等，早期自然流产现象中约有50%~60%是由染色体异常所致。染色体异常患者很可能会将自己的病遗传给下一代，使下一代也患上染色体异常疾病。染色体异常是无法治疗的，要解决染色体异常带来的生育问题，只有利用泰第三代试管婴儿技术对胚胎进行筛查，挑选出没有任何疾病的健康胚胎移植到女性子宫里，避免患者生育不健康孩子情况的发生。 常见染色体异常问题 1染色体平衡易位
人体共有23对染色体，分成1-22号和XX或XY，在细胞遗传学检查中把不同大小、形态、结构和功能之间的染色体易位称为平衡易位。平衡易位的患者一般本人不发生畸形和智力低下,但携带者既可生育正常儿、也可生育平衡易位携带者、畸胎儿或死胎，其几率各占1/4，而且是随机的，后两种情况往往会导致流产。这类流产至少一半是由丈夫引起的，因为胎儿的染色体一半来自母亲，另一半来自父亲，所以妻子流产，丈夫也有必要去做染色体检查。这类流产一般不提倡保胎，怀孕16-20周时孕妇做羊水染色体检查，若发现胎儿异常就必须引产，否则会生育智力低下的畸形儿。 2染色体同源易位 同源易位就是两条同号染色体之间的易位。这种易位使受精后所形成的胚胎100%是异常胎儿，因为多一条染色体的胎儿能生下来的全是严重痴呆畸形儿，少一条染色体的胎儿，除X单体外全是死胎，因此染色体同源易位患者惟一的选择就是不生育，以免痛苦**。 3染色体缺失 基因细胞进行减数分裂时，染色体断裂断片可能会发生丢失，缺乏的断片如果是染色体臂的外端区段，则称顶端缺失；如果是染色体臂的中间区段，称中间缺失。缺失的纯合体可能引起致死或表型异常，如猫叫综合症，就是人类因第5条染色体的短臂缺失而产生的疾病，此种患者哭声似猫叫，其不正常的叫声是由于咽喉构造异常所造成，这种现象于出生后数周即可逐渐改善，其他特点包括出生时体重轻、生长及发育迟缓、智力不足、小头、低位耳、眼距过宽、肌肉紧结性低、断掌等，这类患者经常有喂食困难及呼吸道感染等问题，智商通常不到30。 4染色体重复 指某染色体的个别区段重复出现1次或多次，染色体重复区段内基因数成倍增加。因同源染色体配对不正确且其间发生互换，造成一条染色体发生缺失，另一条发生重复，种类有前后重复、倒转重复、移位重复，以重复的那一段染色体连接位置不同而定。 5染色体倒置 指某染色体内部区段发生180度的倒转，使该区段原来基因顺序发生颠倒的现象。倒位的遗传效应改变了倒位区段内外基因的连锁关系，还使基因的正常表达因位置改变而有所变化，倒位杂合体联会时可形成特征性的倒位环，引起部分不育性，并降低连锁基因的重组率。 6染色体正常 对于染色体检查正常者尚需进一步做有关检查，虽然夫妻双方染色体正常，但胎儿也有发生染色体异常的可能，因为很多染色体异常是由于早期胚胎突变引起的，所以孕妇在未做羊水染色体检查之前，不要盲目保胎，以免生育劣质新生儿。 染色体异常解决方案 目前染色体异常患者想要孩子只能通过第三代试管婴儿助孕来实现生育且避免遗传给下一代。第三代试管婴儿技术（PGD/PGS）可以在胚胎植入子宫前，对胚胎的遗传物质进行筛查诊断，判断其是否存在特定异常，淘汰掉有染色体异常的胚胎，选择健康优质胚胎植入子宫，从而获得正常胎儿。 三代试管婴儿技术在囊胚移植前做PGS/PGD基因筛查诊断是整个技术的关键部分，也是保障三代试管婴儿成功率高的关键。 三代试管婴儿技术利用PGS/PGD基因筛查诊断技术，可以准确检测出125余种染色体疾病，试管医院在囊胚移植前通过基因筛查诊断有效避免新生儿受到遗传疾病的影响。 通过促排卵、取卵取精等方式，在体外完成人工授精，将受精卵在胚胎实验室培育到第5天形成具备80-100个细胞的囊胚，通过PGS/PGD基因筛查诊断技术对胚胎的46条染色体在数目和结构上进行对比，分析胚胎染色体基因是否健康，检查胚胎中是否含有遗传性致病基因。 海外三代试管婴儿移植前基因诊断技术，十分适用于帮助因胚胎基因异常引起的不孕或流产以及对平衡易位的夫妇选择基因平衡的胚胎进行移植，从根本降低自然流产率，提高妊娠质量。筛选优质健康基因移植到女性子宫内，一方面提高着床率，另一方面保证胎儿的健康，从而避免准爸妈将不良遗传基因遗传给胎儿，可以将先天缺陷降到最低的。 做试管婴儿能否避免宫外孕吗 试管婴儿是取出卵子，取出精子，实现体外受精，在形成受精卵的3天（分裂胚）或5-6天（晚期囊胚）进行胚胎的移植。若患者朋友选择3天受精卵（分裂胚）的移植，依然无法避免宫外孕的发生，因为距离胚胎的着床时间依然还有数天的时间。尤其对于既往就有宫外孕史的患者朋友，这种几率并不会因为是试管婴儿而降低。分裂胚移植的试管婴儿发生几率与自然怀孕宫外孕的发生几率相当，宫外孕的发生依然遵循着自然界的规律。而选择移植5-6天受精卵（晚期囊胚）的患者朋友，宫外孕的发生几率就大大降低了。因为在很短的时间胚胎就完成了着床的过程，在有限的时间内，体积较大的胚胎移动到宫外的几率也大大降低，并且囊胚移植的妊娠率也会显著增加。 脂肪干细胞的郑大二附属有供卵的吗提取及鉴定 3.3.2 观察 细胞传代后，每天对细胞进行观察，注意污染与否、细胞贴壁和生长状态等 情况 消化传代。 此过程中所做处理同原代培养。 注意观察细胞五个时期的特点 （游 离期、吸附期、繁殖期、维持期、衰退期）。 细胞已基本铺满瓶壁形成致密单层，这时可进行再次传代培养。 4 细胞镜下作形态学观察及取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞 免疫表型（CD29/CD44）的鉴定 4.1 在细胞镜下作形态学观察， 与正常形态比较 （原代培养后， 传代 2-3 次， ACSs 呈现单层，大而扁的细胞形态，其直径在 25-30um，待细胞达到汇合时，它 们形态上呈纺锤形，类似于成纤维细胞） 4.2 细胞周期分析 分别取生长融合达 30%-40%和 90%以上的第三代细胞，以 4°C 预冷的 70%冰 乙醇固定，4°C 放置 24 小时；用 PBS 洗涤 2 次；加入 RNA 酶 10ug 和碘化丙啶 （PI）0.3ml 重悬细胞（4°C，30 分钟）。用流式细胞仪以 FL2 红色荧光条件检 测。应用 Modfit LT 2.0 软件分析细胞周期。 取第三代细胞用流式细胞仪作细胞周期及细胞免疫表型（CD29/CD44）的鉴 定。 4.2 细胞表面分子免疫标记的鉴定 a.方法：直接免疫荧光法 b．试剂及材料：单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE,及同型对照抗体；细胞洗 液：含 2%BSA、0.1%NaN3 的 PBS；固定液：1%多聚甲醛 PBS 液（pH7.2）；4、流 式细胞仪。 c．操作方法： 6 每个样品取 2 只，分别标记同型抗体作为阴性对照、待测，分别加入 10 个 /100ul 待测细胞。对同型对照管中加入荧光标记单克隆抗体 CD29 、CD44 对照 抗体作为阴性对照，待测管加入荧光标记单克隆抗体 CD29 PE，CD44 PE 为实验 管，各 20ul，混匀。置于于室温避光孵育 30 分钟，加入 2ml 的 PBS，郑大二附属有供卵的吗1200r/min 离心 10min，弃上清，郑大二附属有供卵的吗控干，加入固定液 0.5ml（染色缓冲剂）。先测同型对照， 再测实验管。软件采集数据，分析阳性细胞比例。 二、携带 PTN 表达基因的脂肪干细胞的获取及鉴定 1、实验技术及原理：运用基因转染技术，将带 PTN 基因的反转录病毒载体 转染到脂肪干细胞，抗生素 G418 和流式细胞仪筛选，得到 PTN 高表达的脂肪干 细胞。 2、具体操作： 2.1 材料及试剂： 2.2 脂肪干细胞的准备：被用于作靶基因转染的细胞，其生长状态如何，将 直接决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，必需 应用胰酶处理成单细胞悬液， 重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿 的 60%为宜，转染当日，在转染前 4 小时换一将近新鲜培养液。对于悬浮细胞， 也需在转染前 4 小时换一次新鲜培养液。 2.3 将带 PTN 基因的反转录病毒载体转染到脂肪干细胞，带有 PTN 基因混合 物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边，边加入边轻摇培养 皿，以确保均匀分布和避免局部高浓度。 2.4 用抗生素 G418 和流式细胞仪筛选，得到 PTN 高表达的脂肪干细胞 G418 筛选要做预试验确定最佳浓度， 将细胞稀释至 1000cell/ml， 每孔 100ul 加入有培养基的 24 孔板， 将每孔中的 G418 浓度稀释至 0,100, 200,300, 400,500, 600,700, 800,900, 1000,1100ng/ml 等１2 个级别, 培养 10-14 天，以最低细胞 全部死亡浓度为基准，一般 400-800 左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持 使用筛选浓度的一半 流式细胞仪分析：SHG-44、SHG-44-vect、SHG-44-重组 pcDNA3→单细胞悬 液→70%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析 G1 期 和 G2/M、S 期比例。
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